什么是熒光定量PCR、數(shù)字PCR?

2022-11-23 金夢
一、技術(shù)篇


在全球醫(yī)療器械行業(yè)中,體外診斷是占比最高的細(xì)分領(lǐng)域之一,根據(jù)診斷原理的不同,體外診斷產(chǎn)品分為分子診斷、免疫診斷、生化診斷等多種類型。其中,分子診斷的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性等均較為突出,尤其是在新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下,以PCR為代表的分子診斷技術(shù)得到了加速發(fā)展。

PCR,即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的英文縮寫,是一種以DNA雙鏈復(fù)制原理為基礎(chǔ),對特定核酸樣本進(jìn)行體外擴(kuò)增的生物技術(shù),能夠?qū)⑽⒘康暮怂針颖狙杆倏截愔翈装偃f倍,便于后續(xù)的分析研究。該技術(shù)源起于20世紀(jì)70、80年代,經(jīng)過幾十年的發(fā)展,經(jīng)歷了初代傳統(tǒng)PCR、第二代熒光定量PCR和第三代數(shù)字PCR的演變,在醫(yī)療篩查診斷、生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、法醫(yī)分析鑒定及食品衛(wèi)生和環(huán)境檢測等方面得到廣泛應(yīng)用。


1.熒光定量PCR          

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術(shù),簡稱qPCR,是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)(熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

熒光定量PCR

與普通PCR相比,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù),可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行相對定量、定量和定性分析。

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)過程

(圖:熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)過程)



2.數(shù)字PCR         

數(shù)字PCR即Digital PCR(dPCR),它是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于qPCR,數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù),是對起始樣品的絕對定量。PCR實(shí)際上是一個(gè)在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下,DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng),擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。

數(shù)字PCR技術(shù)原理

(圖:數(shù)字PCR技術(shù)原理)


根據(jù)微反應(yīng)單元的不同形式,數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前,市場上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式。


三代核酸檢測技術(shù)對比:

技術(shù)方法

概念

技術(shù)優(yōu)勢

技術(shù)劣勢

傳統(tǒng)PCR

采用普通PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增靶基因,通過瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析

1.可實(shí)現(xiàn)特定核酸片段的體外復(fù)制

1.相關(guān)核酸染料對操作人員和環(huán)境具有危害

2.易出現(xiàn)假陽性結(jié)果

3.耗時(shí)時(shí)間長、操作復(fù)雜

4.無法準(zhǔn)確定量

熒光定量PCR

是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。

1.污染風(fēng)險(xiǎn)低

2.操作流程更簡單、經(jīng)濟(jì)高效

3.樣品加樣量少

1.不同廠家生產(chǎn)的試劑和設(shè)備之間的差異對檢測結(jié)果影響較大,不具備可比性

2.存在背景值的影響,結(jié)果易產(chǎn)生偏差

3.低拷貝的DNA難以檢測

4.受PCR抑制物的影響較大

數(shù)字PCR

將核酸樣品分配到大量獨(dú)立、平行的微反應(yīng)單元(納升級(jí))中,部分反應(yīng)單元包含靶標(biāo)分子(陽性),而其他不包含(陰性),接著進(jìn)行擴(kuò)增,并利用TaqMan化學(xué)試劑或染料標(biāo)記探針檢測靶標(biāo)序列,能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)分子的絕對計(jì)數(shù)。

1.特異性強(qiáng)、靈敏度高

2.絕對定量,準(zhǔn)確性好

3.抗干擾能力強(qiáng)

1.特異性強(qiáng)、靈敏度高

2.絕對定量,準(zhǔn)確性好

3.抗干擾能力強(qiáng)




一、光學(xué)原理解決方案篇



1.熒光定量PCR       

熒光定量PCR二向色鏡熒光定量PCR


熒光定量PCR光路圖熒光定量PCR光路圖
(圖:熒光定量PCR光路圖)


熒光定量PCR光譜
(圖:熒光定量PCR光譜)


解決方案一:

熒光通道激發(fā)波長發(fā)射波長二向色鏡
技術(shù)參數(shù)
Atto425Ex 430/10Em 480/10\設(shè)計(jì)波段 300-1100nm@OD6
FAMEx 470/10Em 515/10\中心波長誤差±2nm
HEXEx 535/10Em 565/10\半帶寬10±2nm
ROXEx 585/10Em 614/10\實(shí)現(xiàn)方式單片 / 膠合
CY5Ex 630/10Em 670/10\鍍膜工藝磁控濺射 / 真空鍍膜
CY5.5Ex 682/10Em 725/10\峰值透過率>85%

  

解決方案二:

熒光通道激發(fā)波長發(fā)射波長二向色鏡
技術(shù)參數(shù)
FAMEx 470/30Em 520/20505二向色鏡設(shè)計(jì)波段 300-1100nm@OD6
HEXEx 530/20Em 565/20550二向色鏡中心波長誤差±3nm
ROXEx 570/20Em 615/20590二向色鏡半帶寬30±3nm、20±2nm
CY5Ex 630/20Em 675/20647二向色鏡實(shí)現(xiàn)方式單片 / 膠合

鍍膜工藝磁控濺射 / 真空鍍膜
峰值透過率>90%


2.數(shù)字PCR        


數(shù)字PCR濾光片

數(shù)字PCR


數(shù)字PCR光路圖

數(shù)字PCR光譜

(圖:數(shù)字PCR光路圖)(圖:數(shù)字PCR光譜)


解決方案:

熒光通道激發(fā)波長發(fā)射波長二向色鏡
技術(shù)參數(shù)
FAMEx 488/20Em 527/20505二向色鏡設(shè)計(jì)波段 300-1100nm@OD6
HEXEx 527/20Em 567/15550二向色鏡中心波長誤差±2nm
ROXEx 572/28Em 615/24590二向色鏡半帶寬20±2nm
CY5Ex 625/26Em 661/11647二向色鏡實(shí)現(xiàn)方式單片 / 膠合

鍍膜工藝磁控濺射 / 真空鍍膜
峰值透過率>90%


標(biāo)簽: PCR 熒光定量